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Aug 19, 2023

ウイルス

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4101 (2023) この記事を引用 1081 アクセス 1 Altmetric Metrics の詳細 ミオシンの発現と精製は、メカニズムの洞察にとって重要です。

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4101 (2023) この記事を引用

1081 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ミオシンの発現と精製は、正常な機能と突然変異によって引き起こされる変化を機構的に洞察するために重要です。 後者は、突然変異がいくつかの衰弱性疾患を引き起こす横紋筋ミオシン II にとって特に重要です。 しかし、このミオシンの重鎖は発現することが難しく、C2C12 細胞を使用する標準的なプロトコールはウイルス感染に依存しています。 これは時間と労力がかかり、インフラストラクチャの需要と生物学的危険性を伴うため、広範な使用が制限され、さまざまな突然変異の迅速な生成が妨げられます。 私たちはここで、これらの課題を克服するウイルスフリーの方法を開発します。 このシステムを使用して、C2C12 細胞にヒト心臓ミオシン重鎖のモータードメインをトランスフェクトします。 細胞トランスフェクション、培養および回収条件を最適化した後、マウス必須軽鎖および調節軽鎖と同時精製した発現タンパク質の機能を特徴付けました。 in vitro 運動性アッセイにおける滑走速度 (1.5 ～ 1.7 μm/s; 25 °C)、最大アクチン活性化触媒活性 (kcat; 8 ～ 9 s-1) および最大活性の半分のアクチン濃度 (KATPase; 70) –80 μM) は、ウイルスベースの感染を使用して以前に見つかったものと同様でした。 この結果により、新しいタイプの研究、例えば、さらなる特徴付けのために選択される広範囲の突然変異のスクリーニングが可能になるはずである。

ミオシンは、ATP 代謝回転によって駆動される周期的なプロセスでアクチン フィラメントと相互作用することによって力と運動を発生させる分子モーターです。 このプロセスは、筋肉の収縮、非筋細胞の運動性/力の発生、細胞内貨物輸送、細胞シグナル伝達など、さまざまな重要な機能の基礎です1。 最近、ミオシン スーパーファミリーで最大 79 のクラス 2 が同定されました。 それらはすべてミオシン重鎖 (MHC; ~ 90 ～ 250 kD) を中心に構築されており、アクチン結合部位、触媒 ATPase 部位、および運動機能やフィラメントの形成や積荷結合に重要なその他の要素を備えています。 さらに、安定化、調節、調節の役割を持つ軽鎖が各重鎖に結合しています。 ミオシンの運動機能の基本的な機構を洞察するためだけでなく、病気の原因となる変異の詳細な研究のためにも、言及されたすべてのタンパク質成分を発現および精製できることが重要です。

タンパク質の発現および精製に最もよく使用されるシステムは、発現宿主として大腸菌に依存しており、高い精製収率（発現産物が可溶性の場合）および労力とコスト効率が高くなります3。 しかし、原核生物系には、真核生物タンパク質の適切なフォールディングと翻訳後修飾を支援するための完全な細胞機構が欠けています。 機能的なミオシン軽鎖の発現と精製は大腸菌を使用して可能ですが、ミオシン重鎖 (MHC) はこのシステムを使用して機能的な形で生産することはできません 4。 したがって、Dictyostelium 5、6、7、Drosophila melanogaster 8、昆虫細胞 9、10、11、12、13、14、および哺乳動物細胞 15、16 に基づいたさまざまな真核生物の発現および精製システムが開発されています。 これらのシステムは、さまざまな MHC クラスの産生にはうまく機能しますが、脊椎動物の横紋筋ミオシンでは限定的な成功にとどまっています 17、18、19。これは、おそらく筋細胞のタンパク質フォールディング機構をすべて含めることができていないためです。 多くの論文で UNC-45 がミオシンの折り畳みとサルコメアの構築に関与するシャペロンであることが特定されています 20、21、22、23、24 が、Hsp70/Hsp9025 やシャペロニン 26 などの他の因子が関与しているようです。 この見解に沿って、Winkelmannらは、横紋筋ミオシンの完全に機能的な形態への適切な折り畳みが、分化した筋肉様環境、すなわち筋筋管でのみ起こるという証拠を提示した27、28、29。 この考えに基づいて、筋管に分化するマウス C2C12 筋芽細胞が発現宿主細胞株の選択として導入されました 27。 筋芽細胞は、プロモーターの下でニワトリ胎児骨格筋 MHC を保持するプラスミドでトランスフェクトされました。これにより、MHC 発現は筋管への分化時にのみ開始されます。 精製収量は、アクチン活性化 ATPase 活性に基づいてミオシン機能を評価するのに十分でした。 この初期バージョンの C2C12 ベースの発現および精製システム (ここでは「C2C12 ベースのシステム」) での安定した細胞株 27 の生成は、時間の経過とともに比較的高い精製収率と、トランスフェクション サイクルを排除したコスト効率の高いワークフローを提供します。 しかし、安定した細胞株の開発には最大 12 か月かかる場合があり 30、特定のミオシンのいくつかの異なる構築物 (点突然変異など) を調べるには最適なアプローチではありません。 対照的に、一過性発現には開発時間が短く、ターンオーバーが早いという利点があります30。 したがって、C2C12 ベースのシステムは、肥大型心筋症に関連するミオシン点突然変異を導入し、その影響を研究するために、一過性アデノウイルス発現を利用して後に修正されました 31。 同じシステムは、Resnicow ら 32 によってさらに最適化され、組換えヒト骨格および心臓ミオシン アイソフォームの一過性動態解析に十分な量の MHC の生成が可能になりました 33、34、35。 注目すべきことに、これらの研究では、ヒトβ-心臓ミオシン変異体が昆虫細胞から発現および精製された以前の報告19よりも、野生型（WT）および変異体β-心臓ミオシンの両方でかなり高いATPアーゼ活性が達成されました。 現在、C2C12筋管のアデノウイルスベースの感染により、特に重要な機能研究、インビトロ運動性アッセイおよび一過性生化学溶液動態に十分な量の、適切に折り畳まれた機能的な横紋筋ミオシン（S1およびHMM様構築物）の産生が可能になっている34,36。